Джеймс Уэсли Марстерс родился 20 августа в Гринвиле, а вырос в Модесто. Его отец хотел стать министром, а мать почти стала монахиней. У Джеймса есть брат и сестра.
Джеймс окончил Старшую школу Дэвиса и посещал престижный Julliard, Тихоокеанскую консерваторию искусств и Американскую театральную консерваторию. Почти 10 лет он проработал на сцене, играя в различных пьесах в Нью-Йорке, Чикаго и Сиеттле. Потом он переехал в Лос-Анджелес, чтобы начать телевизионную карьеру.
После нескольких гостевых ролей на шоу таких как "Northern Exposure" и "Moloney" к нему пришла известность в 1997 году с ролью английского вампира с обесцвеченными волосами по имени Спайк в сериале «Баффи – истребительница вампиров». Изначально он появлялся только в нескольких эпизодах, но Марстерс смог завоевать любовь зрителей, и его контракт был продлен на весь четвертый сезон и дальше.
Кроме работы в «Баффи», Джеймс Марстерс играл эпизодические роли в таких шоу как "Millennium", "Strange Frequency" и "Andromeda" , также он работал еще в нескольких фильмах. Марстерс получил небольшую роль в 1999 году в "The House On Haunted Hill" и главную роль в "Winding Roads". Кроме того, он продолжал работу на Лос-анджелесской сцене.
Другие его таланты – игра на гитаре и пение. Иногда он играет в клубе Santa Monica, Калифорния. Он даже сформировал группу названную “Ghost of the robot” (Призрак робота) (основной состав которой всего два человека – Джеймс и Чарли ДеМарс).
В настоящее время Джеймс Марстерс живет в Лос-Анджелесе.